La espectroscopía de fluorescencia, una técnica avanzada dentro del campo de la fotoluminiscencia, se ha establecido como un recurso esencial no solo en áreas como la química analítica y la biología molecular, sino también en el análisis y control de calidad de alimentos[1]. Esta metodología, destacada por su excepcional sensibilidad y selectividad, es crucial para la identificación precisa y la cuantificación de compuestos bioactivos, contaminantes y adulterantes.

 

En este artículo, se presenta un compendio de estrategias para la aplicación efectiva de la técnica [2]. Para ello se tratarán los fundamentos del fenómeno, las distintas tipologías de fuentes de luz, la correcta elección de las cubetas y la influencia de los fenómenos conocidos como quenching (extinción de la fluorescencia), inner filter (filtro interno) y background autofluorescence (autofluorescencia de fondo), fundamental para la interpretación correcta de los resultados.

 

Fundamentos de la fluorescencia y su aplicación en la espectroscopía

 La fluorescencia, un fenómeno óptico en el que ciertas moléculas, llamadas fluoróforos, absorben fotones de luz para transitar hacia un estado excitado de mayor energía. Tras esta excitación, los fluoróforos vuelven a su estado basal, emitiendo fotones de mayor longitud de onda. No profundiza en este fenómeno, que se describe con detalle en un artículo publicado con anterioridad.

 

Este proceso, notorio por su elevada especificidad y sensibilidad, posibilita la detección de alteraciones sutiles en la composición molecular de una muestra. Tanto la intensidad como la duración y el espectro de la luz emitida proporcionan información acerca de la estructura y el microentorno molecular del fluoróforo.

 

Diversos factores ejercen influencia sobre la eficacia y las propiedades de la fluorescencia, entre ellos, la concentración del fluoróforo, las condiciones químicas del entorno, la temperatura y el pH. Las interacciones entre los fluoróforos (naturales o añadidos) y su entorno pueden inducir modificaciones en la intensidad y en el espectro de emisión, lo cual se aprovecha para investigar las características químicas y físicas de las muestras.

 

Fuentes de luz en espectroscopía de fluorescencia

La selección de una fuente de luz adecuada es crucial en espectroscopía de fluorescencia. La eficiencia en la excitación de los fluoróforos depende significativamente de la correspondencia entre el espectro de emisión de la fuente de luz y el espectro de absorción del fluoróforo.

 

Existen diversos tipos de fuentes de luz basadas en diferentes tecnologías:

 

Lámparas de Xenón y de Arco de Mercurio

Ventajas: Proporcionan un espectro de luz continuo desde el ultravioleta hasta el infrarrojo cercano, adecuado para una amplia gama de fluoróforos. Son versátiles y permiten la excitación de múltiples fluoróforos.

Inconvenientes: Pueden causar un calentamiento excesivo de la muestra y tienen una vida útil limitada. Además, su espectro continuo requiere filtros adicionales para seleccionar la longitud de onda deseada.

 

LEDs (Diodos Emisores de Luz)

Ventajas: Ofrecen una emisión de luz con un espectro más estrecho para una excitación más selectiva, lo que reduce la interferencia de luz no deseada. Son energéticamente eficientes, tienen una larga vida útil y permiten un control rápido y preciso de la intensidad. Su coste es inferior al resto de tecnologías.

Inconvenientes: La selección limitada de longitudes de onda puede no ser adecuada para todos los fluoróforos. Un LED no cubre un amplio rango de excitación pudiendo ser necesarios múltiples LED.

 

Láseres

Ventajas: Generan luz coherente y monocromática, lo que permite una excitación altamente específica y eficiente. Son ideales para técnicas como la microscopía de fluorescencia y la citometría de flujo.

Inconvenientes: Los láseres suelen ser más costosos y pueden causar fotodegradación de la muestra debido a su alta intensidad. La selección de longitud de onda es limitada y requiere diferentes tipos de láser para diferentes aplicaciones. Además, son sensibles a la temperatura y requieren de un control preciso de esta.

 

Pyroistech ofrece fuentes de luz que combinan múltiples LEDs en un único equipo. Esta configuración puede ser personalizada con una amplia gran gama de LEDs en diferentes rangos que permiten adaptarse a la mayoría de las aplicaciones.

 

Además del tipo de fuente de luz hay que tener en cuenta la intensidad de la luz de excitación. Ésta es un parámetro crítico, ya que una intensidad demasiado baja puede no excitar suficientemente los fluoróforos, mientras que una intensidad demasiado alta puede llevar a la fotodegradación de la muestra o a la saturación del detector.

 

La elección de la fuente de luz y la configuración experimental debe hacerse cuidadosamente para minimizar los efectos de dispersión de luz, especialmente en muestras turbias o heterogéneas. La dispersión puede afectar la calidad de los datos de fluorescencia y conducir a interpretaciones erróneas.

 

Uso y Selección de Cubetas

Las cubetas son componentes cruciales en espectroscopía de fluorescencia, actuando como recipientes transparentes para muestras líquidas [3]. La precisión en las mediciones depende en gran medida de la calidad de las cubetas utilizadas, defectos menores como rayones o impurezas pueden perturbar la transmisión de luz y conducir a inexactitudes.

Las cubetas para fluorescencia tienen al menos tres lados pulidos, con la fuente de luz y el detector ubicados a 90 grados entre sí, minimizando la detección de luz incidente y maximizando la detección de la luz emitida. Se debe tener cuidado en no confundirlas con cubetas de espectrofotometría, ya que puede llevar a problemas e inexactitudes debido a que están diseñadas para medir la absorción de la luz con únicamente dos lados pulidos.

 

Materiales Disponibles en Cubetas

• Cubetas de Vidrio: Comunes y compatibles con una amplia gama de solventes, disponibles en diferentes tipos de vidrio como borosilicato y cuarzo.
• Cubetas de Plástico: Desechables, ligeras y menos propensas a romperse. Fabricadas en diversos tipos de plástico como poliestireno y PMMA.
• Cubetas de Cuarzo: Usadas para aplicaciones que requieren alta claridad óptica y transparencia UV. Resistentes al calor y a ataques químicos.

 

Parámetros de la cubeta:

• Formas de Cubeta: Rectangulares (comunes para ensayos rutinarios), cuadradas (para aplicaciones que requieren luz desde múltiples ángulos), cilíndricas (para experimentos de dicroísmo circular), y de flujo (para aplicaciones de flujo continuo).
• Volumen de Cubeta: Varía para adaptarse a diferentes volúmenes de muestra, desde microlitros hasta varios mililitros.
• Longitud del camino Óptico (Path Length): Crucial, ya que afecta la cantidad de luz absorbida por la muestra. La longitud estándar es de 10 mm, pero hay disponibles longitudes más cortas o más largas para muestras concentradas o diluidas, respectivamente. Es importante calibrar y tener en cuenta la longitud del camini óptico en los cálculos para asegurar mediciones precisas cuando se utilizan cubetas de distintas longitudes

 

La selección cuidadosa de cubetas es vital para la fiabilidad y precisión en la espectroscopía. La compatibilidad con el equipamiento, junto con la consideración del material, volumen y diseño de la cubeta, juega un papel crucial para la obtención de resultados satisfactorios en las medidas.

 

Fenómenos que Afectan la Fluorescencia

En la espectroscopía de fluorescencia, la interpretación precisa de los resultados depende no solo de la comprensión de las características del fluoróforo, sino también del reconocimiento y manejo de varios fenómenos que pueden influir significativamente en la medición de la fluorescencia.

 

Quenching de la Fluorescencia

El quenching, o extinción de la fluorescencia, es un proceso que disminuye la intensidad de la fluorescencia de un fluoróforo [4]. Este fenómeno puede ser causado por factores, como la interacción con otras moléculas, cambios en el entorno químico o físico y la transferencia de energía. Esto puede afectar la cuantificación de la fluorescencia y debe ser considerado el fenómeno al interpretar los resultados de espectroscopía de fluorescencia. Se puede dividir en Quenching Estático y Dinámico: El quenching estático ocurre cuando el fluoróforo forma un complejo no fluorescente con otra molécula, mientras que el quenching dinámico implica la transferencia de energía del fluoróforo excitado a otra molécula.

 

Efecto del Filtro Interno

El efecto del filtro interno se refiere a la absorción de la luz de excitación o emisión por componentes de la muestra que no son el fluoróforo de interés [5]. Esto puede conducir a una subestimación de la intensidad de fluorescencia, especialmente en muestras concentradas o complejas.

Se pueden emplear técnicas de dilución y algoritmos matemáticos para corregir el efecto del filtro interno. La selección cuidadosa de las longitudes de onda de excitación y emisión también puede ayudar a minimizar este efecto.

 

Autofluorescencia de fondo

La autofluorescencia de fondo es la emisión de luz por componentes de la muestra distintos del fluoróforo objetivo. Este fenómeno puede interferir con la detección y cuantificación del fluoróforo de interés, especialmente en muestras biológicas o complejas. Es crucial distinguir entre la fluorescencia específica del fluoróforo y la autofluorescencia de fondo. El uso de técnicas de filtrado y el ajuste de las condiciones experimentales, como la longitud de onda de excitación, pueden ayudar a diferenciar estas señales. En el análisis de datos, es importante tener en cuenta la contribución de la autofluorescencia de fondo y aplicar correcciones si es necesario.

 

 

Conclusión

En resumen, la espectroscopía de fluorescencia se consolida como una técnica imprescindible y versátil en el ámbito científico y tecnológico, valorada por su sensibilidad y selectividad. Este artículo ha abarcado desde los principios fundamentales del fenómeno de fluorescencia hasta las consideraciones prácticas en su aplicación, como la elección de fuentes de luz y cubetas adecuadas, y el manejo de fenómenos como el quenching y la autofluorescencia. La espectroscopía de fluorescencia, con su enfoque detallado y metodología refinada, sigue siendo una herramienta fundamental en la investigación y desarrollo en múltiples disciplinas.

 

Bibliografía:

[1]     Ahmad MH, Sahar A, Hitzmann B. Fluorescence spectroscopy for the monitoring of food processes. Meas Model Autom Adv Food Process 2017:121–51.

[2]     Jameson DM, Croney JC, Moens PDJBT-M in E. Fluorescence: Basic concepts, practical aspects, and some anecdotes. Biophotonics, Part A, vol. 360, Academic Press; 2003, p. 1–43. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/S0076-6879(03)60105-9.

[3]     Cuvettes for Spectrophotometer: a Comprehensive Guide n.d. https://qvarz.com/cuvettes-for-spectrophotometer/.

[4]     Lakowicz JR. Quenching of Fluorescence BT  – Principles of Fluorescence Spectroscopy. In: Lakowicz JR, editor., Boston, MA: Springer US; 1983, p. 257–301. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-7658-7_9.

[5]     Kumar Panigrahi S, Kumar Mishra A. Inner filter effect in fluorescence spectroscopy: As a problem and as a solution. J Photochem Photobiol C Photochem Rev 2019;41:100318. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.jphotochemrev.2019.100318.